產(chǎn)品介紹
Calcein AM /PI試劑盒
CAT：#30002；Unit Size #500 assays
鈣黃綠素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分別對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞染色，可用于同時(shí)對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行熒光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯親脂性很高，使其可透過細(xì)胞膜。盡管Calcein-AM本身并不是熒光分子，但通過活細(xì)胞內(nèi)的酯酶作用，Calcein-AM能脫去AM基，產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強(qiáng)綠色熒光 (激發(fā): 490 nm，發(fā)射: 515 nm)。因此Calcein-AM僅對(duì)活細(xì)胞染色。另一方面，作為核染色染料的PI不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜。它穿過死細(xì)胞膜的無序區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的DNA雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 (激發(fā): 535 nm，發(fā)射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時(shí)觀察活細(xì)胞和死細(xì)胞。用545 nm激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，我們建議個(gè)別確定Calcein-AM和PI的合適濃度。
I. 試劑 Calcein-AM 2mM 50uL in DMSO; ·PI (1.5mM) 150uL in water
II. 用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)
以HeLa細(xì)胞染色為例，請(qǐng)注意不同的細(xì)胞種類、不同濃度，有不同的觀察條件。根據(jù)細(xì)胞條件，摸索不同條件下的細(xì)胞貼壁情況和試劑濃度的配制等最佳條件。
1. 染色溶液的配制
1) 用1 ml無水DMSO溶解2 mg Calcein-AM，制備成2 mmol/l的Calcein-AM儲(chǔ)備液，-20℃下密閉冷凍保存。
2) 用1 ml ddH2O溶解2 mg PI，制備成3 mmol/l的PI儲(chǔ)備液，-20度下密閉冷凍保存，可以保存一年。
3) 將Calcein-AM儲(chǔ)備液和PI儲(chǔ)備液放置于室溫。
4) 加5 μl Calcein-AM儲(chǔ)備液和15 μl PI儲(chǔ)備液至5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的終濃度為2 μmol/l，PI的終濃度為4.5 μmol/l。
2. 細(xì)胞染色
1) 染色HeLa細(xì)胞等貼壁細(xì)胞時(shí)，先用Trypsin-EDTA等消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液。
2) 將細(xì)胞懸液離心3分鐘 (1,000 rpm)。
3) 去除上清液，加入PBS緩沖液，細(xì)胞數(shù)量調(diào)整至10e5-10e6個(gè)/ml。再用移液器充分混勻。
4) 由于培養(yǎng)基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水會(huì)分解，會(huì)導(dǎo)致空白上升，所以需要離心數(shù)次，用PBS洗滌數(shù)次直到完全洗凈。
5) 將200 μl細(xì)胞懸液移至小試管中，加入100 μl染色溶液，在37℃下孵育15分鐘。
6) 在蓋玻片上滴加適量的染色的細(xì)胞溶液。
7) 在熒光顯微鏡下，先用490±10 nm波長(zhǎng)激發(fā)，觀察黃綠色的活細(xì)胞，還可以同時(shí)觀察到紅色的死細(xì)胞，然后用545 nm波長(zhǎng)激發(fā)，能夠看到紅色的死細(xì)胞。
3. 染色試劑的最佳濃度
Calcein-AM和PI最佳濃度根據(jù)不同的細(xì)胞種類而定，通過以下的操作，我們可以找到不同細(xì)胞染色試劑的最佳濃度。
1) 通過在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黃皂苷中孵育10分鐘或通過在70%乙醇中孵育30分鐘制備死細(xì)胞。
2) 用0.1-10 μM PI溶液對(duì)死細(xì)胞染色，以便找到僅對(duì)細(xì)胞核染色而不對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的PI濃度。
3) 用0.1-10 μM Calcein-AM溶液對(duì)死細(xì)胞染色，以便找到不對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色的Calcein-AM濃度。接著用該濃度的Calcein-AM對(duì)活細(xì)胞染色以檢驗(yàn)活細(xì)胞可否被染色。
III. 注意事項(xiàng)
1) Calcein-AM的ester部位遇到濕氣會(huì)分解，使用后請(qǐng)?jiān)?/span>-20度下密閉冷凍保存，防止水分進(jìn)入。Calcein-AM儲(chǔ)備液用緩沖液或培養(yǎng)基等稀釋時(shí)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
2) 使用時(shí)一定要帶手套、眼罩、口罩。萬一接觸到皮膚的話，迅速使用大量水清洗。
3）注意事項(xiàng)：本公司所有產(chǎn)品僅限用于研發(fā)，操作時(shí)必須戴口罩/手套/實(shí)驗(yàn)服和其它生化實(shí)驗(yàn)室防護(hù)措施。
