Annexin V-Super Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒
| Catalogue No | Specification | Exw Reference Price( RMB) | Qty Avail |
|---|---|---|---|
| QTF1017-20 | 20T | 600 | 大量 |
| QTF1017-50 | 50T | 1200 | 大量 |
| QTF1017-100 | 100T | 2000 | 大量 |
產(chǎn)品介紹
Annexin V-Super Fluor 647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒
產(chǎn)品介紹：
磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負電荷的磷脂，正常細胞中，PS只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細胞膜外側(cè)，使PS暴露在細胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。
將Annexin V進行紅色熒光Super Fluor 647標記，以標記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。
圖1. 細胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖
試劑盒組份：
Reagents | 20 assays | 50 assays | 100 assays | Storage |
Annexin V-Super Fluor 647 | 100 μl | 250 μl | 500 μl | 4°C避光 |
Propidium Iodide, PI | 200 μl | 500 μl | 1000 μl | 4°C避光 |
Binding Buffer ( 4′ ) | 4 mL | 10 mL | 20 mL | 4°C |
所需實驗器材：
微量移液器；PBS； 不含EDTA的胰酶消化液； 低速離心機； 流式細胞儀
注意事項：
1) 所有產(chǎn)品僅限用于研發(fā)，必須生物技術(shù)人員操作同時佩戴口罩/手套/實驗服并遵守生物實驗室安全操作規(guī)程！
2) 微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。
3) Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
4) Annexin V-Super Fluor 647中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN3）, 操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
5) 本試劑盒用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數(shù)量不應(yīng)低于1x106。
6) 染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
7) Annixin V檢測凋亡細胞的方法適用于懸浮生長的細胞，如：淋巴細胞等細胞的檢測。對于貼壁生長的細胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測，可將胰酶消化后的細胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復(fù)性較差，且需要操作時非常小心。
8) 消化貼壁細胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-Super Fluor 647，最終導(dǎo)致染色失敗。
9) 細胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。
操作說明：
1. 細胞樣品的準備：
a) 懸浮細胞：
1) 收集細胞至離心管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。
2) 用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
3) 再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
b) 貼壁細胞：
1）吸出細胞培養(yǎng)液至離心管中，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量不含EDTA的胰酶細胞消化液消化細胞。
2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
3）加入步驟i中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
注：加入步驟i中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-Super Fluor 647導(dǎo)致染色失敗。
4）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
5）再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。
2. 用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離子水）；
3. 用250ml結(jié)合緩沖液重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml；
4. 取100ml的細胞懸液于5 ml流式管中，加入Annexin V- Super Fluor 647，輕輕混勻；
5. 室溫(20-25℃)避光孵育10min；
6. 上機前5min加入10ml 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；
7. 上機前在反應(yīng)管中補加400ml PBS重懸細胞， 避光保存， 隨即進行流式細胞儀（FACS）檢測， Annexin V- Alexa Fluor 647和PI均為紅色熒光。
圖2. 流式細胞儀檢測早期凋亡細胞。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限是凋亡晚期細胞和壞死細胞。
特別提醒：
1) 本公司所有產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于生命科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅！
2) 本公司所有產(chǎn)品必須由合格專業(yè)技術(shù)人員操作同時佩戴口罩/手套/實驗服并遵守生物實驗室安全操作規(guī)程！
參考文獻：
1. Wu XX, Sun Y, Zhou XB, Zhang J, Yu BY, Xu Q.Effect of Bufotalin on the Apoptosis of BGC-823 Cells.Chinese medicine and clinical pharmacology of new drugs.2007 March,Vol.18 No.2.
2. Yang L, Zhou X, Yang J, Yin X, Han L, Zhao D. Aspirin inhibits cytotoxicity of prion peptide PrP106-126 to neuronal cells associated with microglia activation in vitro. J Neuroimmunol. 2008 Aug 13;199(1-2):10-7.
3. Gao C, Jiang Y, Tan C, Zu X, Liu H, Cao D. Synthesis and potent antileukemic activities of 10-benzyl-9(10H)-acridinones. Bioorg Med Chem. 2008 Sep 15;16(18):8670-5. Epub 2008 Aug 5.
4. Wang LM, Li QY, Zu YG, Fu YJ, Chen LY, Lv HY, Yao LP, Jiang SG. Anti-proliferative and pro-apoptotic effect of CPT13, a novel camptothecin analog, on human colon cancer HCT8 cell line. Chem Biol Interact. 2008 Nov 25;176(2-3):165-72. Epub 2008 Jul 30.
5. Wang L, Li Z, Wang C, Yang Y, Sun L, Cai X, Wu G, Zhou F, Zha X. E-cadherin decreased human breast cancer cells sensitivity to staurosporine by up-regulating Bcl-2 expression. Arch Biochem Biophys. 2009 Jan 1;481(1):116-22. Epub 2008 Nov 1.
6. Yan HL, Xue G, Mei Q, Wang YZ, Ding FX, Liu MF, Lu MH, Tang Y, Yu HY, Sun SH. Repression of the miR-17-92 cluster by p53 has an important function in hypoxia-induced apoptosis. EMBO J. 2009 Sep 16;28(18):2719-32. Epub 2009 Aug 20.
7. Ji YB, Qu ZY, Zou X. Juglone-induced apoptosis in human gastric cancer SGC-7901 cells via the mitochondrial pathway. Exp Toxicol Pathol. 2009 Oct 6.