Annexin V-Super Fluor 488/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品介紹：

磷脂酰絲氨酸（PS）是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常細(xì)胞中，PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè)，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被公認(rèn)為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。
    將Annexin V進(jìn)行綠色熒光Super Fluor 488標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但對凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法，就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限是凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞。

                 圖1. 細(xì)胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸（PS）外翻示意圖

試劑盒組份：

所需實驗器材：

微量移液器；PBS； 不含EDTA的胰酶消化液； 低速離心機(jī)； 流式細(xì)胞儀

注意事項：

1)       此試劑盒僅供研究使用。

2)       微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。

3)       Propidium Iodide（PI）有毒，操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

4)       Annexin V-Super Fluor 488中含有劇毒成分疊氮化鈉（NaN₃）, 操作時要帶手套，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。

5)       本試劑盒用于檢測活細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測時，細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于1x10⁶。

6)       染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。

7)       Annixin V檢測凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長的細(xì)胞，如：淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測。對于貼壁生長的細(xì)胞，由于在胰酶等消化處理過程中會造成細(xì)胞膜的損傷，會造成較高的假陽性，而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團(tuán)，而影響檢測，可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前，包括國外也有一些單位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測。因為其重復(fù)性較差，且需要操作時非常小心。

8)       消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-Alexa Fluor 488，最終導(dǎo)致染色失敗。

9)       細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

操作說明：

1.     細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：

a)      懸浮細(xì)胞：

1)       收集細(xì)胞至離心管中1000-2000rpm離心5min，小心去除上清。

2)       用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

3)       再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

b)      貼壁細(xì)胞：

1）吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量不含EDTA的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。

2）室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。

3）加入步驟i中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

注：加入步驟i中的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V- Alexa Fluor 488導(dǎo)致染色失敗。

4）用1ml 4℃預(yù)冷PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

5）再加入1ml 4℃預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，1000-2000rpm離心5min，小心吸除上清。

2.      用去離子水按1：4稀釋Binding Buffer（4ml Binding Buffer+12ml去離子水）；

3.      用250ml結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×10⁶/ml；

4.      取100ml的細(xì)胞懸液于5 ml流式管中，加入Annexin V- Alexa Fluor 488，輕輕混勻；

5.      室溫(20-25℃)避光孵育10min；

6.      上機(jī)前5min加入10ml 碘化丙啶溶液，輕輕混勻；

7.      上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加400ml PBS重懸細(xì)胞， 避光保存， 隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀（FACS）檢測， Annexin V- Super Fluor 488和PI均為紅色熒光。

Fig  1. Flow cytometry detects early apoptotic cells. The cells in the lower  right quadrant are the early apoptotic cells, and the upper right  quadrant is apoptosis terminal cell and necrotic cell.

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